Galileo sinh tại Pisa (khi ấy là một phần của Lãnh địa công tước Firenze), Italia, con cả trong số sáu người con của Vincenzo Galilei, một người chơi đàn luýt và nhà lý luận âm nhạc nổi tiếng, và Giulia Ammannati. Bốn trong số sáu người con sống qua tuổi sơ sinh, và người con út Michelangelo (hay Michelagnolo) trở thành một người chơi đàn luýt và nhà soạn nhạc nổi tiếng.

Tên đầy đủ của Galileo là Galileo di Vincenzo Bonaiuti de' Galilei. Khi ông lên 8, gia đình ông chuyển tới Firenze, nhưng ông ở lại cùng Jacopo Borghini trong hai năm.[1] Sau đó ông đi học tại Tu viện Camaldolese ở Vallombrosa, 35 km phía đông nam Firenze.[1] Dù khi còn trẻ ông nghiêm túc đi theo con đường tu sĩ, nhưng ông cũng theo học y tại Đại học Pisa theo yêu cầu của cha mình. Ông không hoàn thành khoá học, mà thay vào đó nghiên cứu toán học.[11] Năm 1589, ông được chỉ định làm giáo sư toán tại Pisa. Năm 1591 cha ông mất và ông được giao phó việc chăm lo người em trai Michelagnolo. Năm 1592, ông tới Đại học Padua, dạy địa lý, cơ khí, và thiên văn học cho tới năm 1610.[12] Trong giai đoạn này Galileo đã thực hiện những khám phá quan trọng trong cả khoa học lý thuyết (ví dụ, động học của chuyển động và thiên văn học) và khoa học ứng dụng (ví dụ, sức bền vật liệu, cải tiến kính thiên văn). Các quan tâm của ông gồm nghiên cứu chiêm tinh, mà ở thời tiền hiện đại được xem là liên quan với việc nghiên cứu toán học và thiên văn học.[13]

Dù là một tín đồ sùng đạo của Giáo hội Công giáo Rôma[14], Galileo có ba đứa con ngoài giá thú với Marina Gamba. Họ có hai con gái, Virginia sinh năm 1600 và Livia sinh năm 1601, và một con trai, Vincenzo, sinh năm 1606. Vì là con ngoài giá thú, ông cho rằng các cô con gái của mình không thể lập gia đình. Tương lai duy nhất của họ là tôn giáo. Cả hai cô gái đều được gửi tới nhà dòng kín San Matteo ở Arcetri và sống trọn đời ở đó.[15] Virginia lấy tên Maria Celeste khi vào nhà tu. Bà mất ngày 2 tháng 4 năm 1634, và được chôn cất cùng Galileo tại Basilica di Santa Croce di Firenze. Livia lấy tên Arcangela và ốm đau trong suốt cuộc đời. Vincenzo sau này được hợp pháp hoá và cưới Sestilia Bocchineri.[16]

Năm 1610 Galileo xuất bản một cuốn sách về các quan sát thiên văn của mình với các vệ tinh của Sao Mộc, sử dụng quan sát này để ủng hộ lý thuyết nhật tâm của vũ trụ của Kopernik chống lại thuyết địa tâm Ptolemaeus và các lý thuyết của Aristoteles. Năm sau đó, Galileo tới thăm Roma để chứng minh kính viễn vọng của mình trước các nhà triết học và toán học của Học viện Dòng Tên Rôma (Collegio Romano), và để họ tự thấy bằng mắt mình sự thực về bốn vệ tinh của Sao Mộc.[17] Khi ở Roma ông cũng trở thành một thành viên của Accademia dei Lincei.[18]

Năm 1612, xuất hiện sự chống đối thuyết nhật tâm của vũ trụ đang được Galileo ủng hộ. Năm 1614, từ bục giảng kinh của Vương cung thánh đường Santa Maria Novella, linh mục Tommaso Caccini (1574–1648) lên án các ý kiến của Galileo về sự chuyển động của Trái Đất, cho rằng chúng là nguy hiểm và gần với sự dị giáo. Galileo tới Roma để bảo vệ mình trước những cáo buộc đó, nhưng, vào năm 1616, hồng y Roberto Bellarmino đích thân khiển trách Galileo bắt ông không được ủng hộ cũng như giảng dạy thiên văn học Kopernik.[19] Trong năm 1621 và 1622, Galileo đã viết cuốn sách đầu tiên của mình, Người thí nghiệm (Il Saggiatore), được phê duyệt và cho phát hành năm 1623. Năm 1630, ông quay lại Roma để xin giấy phép in cuốn Đối thoại về hai Hệ thống Thế giới, được xuất bản tại Firenze năm 1632. Tuy nhiên, vào tháng 10 năm ấy, ông bị bắt phải ra trước Thánh bộ Giáo lý Đức tin ở Roma.

Sau một phiên xử của Giáo hoàng, theo đó ông bị nghi ngờ mạnh mẽ là dị giáo, Galileo bị quản thúc tại gia và các hoạt động của ông bị Giáo hoàng kiểm soát. Từ năm 1634 trở về sau, ông sống tại ngôi nhà thôn quê ở Arcetri, bên ngoài Firenze. Ông bị mù hoàn toàn năm 1638 và bị chứng thoát vị và mất ngủ đầy đau đớn, vì thế ông được cho phép tới Firenze chữa bệnh. Ông tiếp tục tiếp khách cho tới năm 1642, sau khi qua đời vì sốt và chứng tim đập nhanh.[20][21]